Saggio dell'ormone tiroideo e sistema di reagenti che utilizzano furosemide. – ABBOTT LAB

La presente invenzione è diretta verso un metodo per misurare gli ormoni tiroidei come la tiroxina (T4) e la triiodotironina (T3) in campioni biologici. Il metodo comprende l'uso di furosemide (acido 4-cloro-N- (2-furilmetil) -5-sulfamoilantranilico) o suoi analoghi per spostare gli ormoni tiroidei dalle proteine ​​leganti in modo tale che gli ormoni tiroidei possano essere misurati con reagenti di analisi adatti. La furosemide ha il vantaggio di non inibire il legame degli ormoni tiroidei o dei traccianti all'anticorpo impiegato nel saggio perché ha una reattività crociata molto bassa con l'anticorpo.

La misurazione delle concentrazioni di T3 e T4 in campioni biologici come plasma e siero è molto preziosa nella diagnosi e nel trattamento di varie malattie e condizioni fisiologiche. Nel siero umano normale, circa il 99,97% di T4 e il 99,7% di T3 presenti, è legato a proteine ​​come la globulina legante la tiroxina (TBG), la prealbumina (TBPA) e l'albumina; il restante 0,03% di T4 e 0. Il 3% di T3 è presente come ormoni non legati (dializzabili o liberi). La concentrazione sierica degli ormoni tiroidei, insieme ad altri fattori come la secrezione e degradazione tiroidea, dipende anche dalla concentrazione sierica di TBG; altre proteine ​​leganti nel siero sono relativamente meno importanti poiché la loro affinità di legame per gli ormoni tiroidei è di gran lunga inferiore a quella del TBG.

La concentrazione di TBG è elevata in condizioni come la gravidanza, il trattamento con estrogeni o un'anomalia genetica; In queste situazioni la T4 e la T3 sierica totali sono aumentate. Al contrario, la concentrazione sierica di TBG è ridotta durante il trattamento con androgeni oa causa di un deficit genetico di TBG. Ciò è associato a una diminuzione delle concentrazioni di ormoni tiroidei. Tuttavia, in una delle situazioni sopra menzionate di concentrazione TBG alterata, il paziente può essere eutiroideo e le concentrazioni di T4 e T3 libere e quelle di T4 e T3 totali corrette per anormalità TBG rientrano nell'intervallo dei soggetti normali.

Il brevetto US 3.911.096 descrive un metodo di dosaggio radioimmunologico per determinare le concentrazioni di T3 o T4 in campioni di siero umano. Il metodo incuba il campione di siero con barbital o altri tamponi per spostare T3 o T4 con un "agente bloccante", T3 o T4 marcato radioattivo e anticorpo specifico per T3 o T4. La quantità di T3 o T4 radioattivo legato viene quindi misurata per determinare la concentrazione dell'ormone rispetto a una curva standardizzata. Gli "agenti bloccanti" possono includere acido 8-anilino-1-naftalensolfonico <..> ANS), acido 3- (4-anilino-1-naftilazo) 2,7-naftalene disolfonico (ANNDS), 2,4, Acido 6-trinitro benzensolfonico (TNBS), acido naftalensolfonico, Thimerosal, 5,5-difenil 2-tioidantain, Doxepin HCl, Diazepam, sodio salicilato, proclorperazina, alofenato (MK-185) Merck, Sharpe e Dohme.

Metodi più recenti non utilizzano barbital o tamponi ma invece impiegano solo i cosiddetti "agenti bloccanti" come descritto nel brevetto US 3.911.096 come ANS. Uno svantaggio di ANS è che è sensibile alla luce e può interferire con le misurazioni dell'assorbimento.

I metodi precedenti utilizzavano l'estrazione con solvente, la digestione enzimatica del campione o altri agenti per estrarre l'ormone T3 o T4. Questi metodi si sono rivelati macchinosi e le fasi del trattamento hanno interferito con la determinazione accurata delle concentrazioni di ormoni tiroidei. Pertanto è auspicabile un metodo migliorato per la determinazione degli ormoni T3 e T4. Riepilogo dell'invenzione

La presente invenzione è diretta verso un metodo per misurare la concentrazione di un ormone tiroideo selezionato dal gruppo costituito da tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) in un campione comprendente il trattamento di un campione con furosemide per sostituire T3 e T4 dalle proteine ​​leganti e misurare la quantità di T3 e T4 spostati. La quantità di T3 e T4 spostati viene misurata utilizzando uno qualsiasi di una varietà di reagenti e metodi noti per il dosaggio dell'ormone tiroideo. Preferibilmente, la furosemide sostituisce qualsiasi altro agente di spostamento o "popper" e fasi di spostamento precedentemente impiegate in un sistema o metodo di reagente convenzionale.

La quantità di furosemide utilizzata è calcolata per spostare sostanzialmente tutti i T3 e T4 in funzione della dimensione del campione. Il metodo di rilevamento può essere fluorescenza, assorbimento, polarizzazione della fluorescenza, chemiluminescenza o mezzi radioattivi.

In un altro aspetto, la presente invenzione è diretta verso un sistema di reagenti progettato per misurare la concentrazione di un ormone tiroideo selezionato dal gruppo costituito da tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) in un campione comprendente furosemide in una quantità sufficiente a spostare sostanzialmente tutti T3 e T4 si legano alle proteine ​​leganti in un campione.

Il resto del sistema reagente può essere uno qualsiasi di una varietà di sistemi reagenti tiroidei. Preferibilmente, la furosemide sostituisce tutto l'agente di spostamento convenzionale o "popper" o fase di spostamento generalmente impiegata in un tale sistema di reagenti tiroidei. I sistemi di reagenti e le metodologie possono comprendere il dosaggio immunoenzimatico fluorescente, il dosaggio immunologico di polarizzazione fluorescente, il dosaggio immunologico a chemiluminescenza, il dosaggio radioimmunologico e il dosaggio immunoenzimatico colorimetrico per citarne alcuni. Descrizione dettagliata dell'invenzione

Viene descritto un metodo per determinare la tiroxina (T4) e la triiodotironina (T3) in campioni biologici come sangue intero, siero e plasma. Il metodo utilizza la furosemide come spiazzante nei test immunologici per gli ormoni tiroidei. Sposta gli ormoni dai loro leganti proteici come la globulina legante la tiroxina (TBG), l'albumina e la prealbumina in modo tale che la misurazione diretta di questi ormoni nel siero o nel plasma possa essere effettuata con un anticorpo appropriato.

La furosemide è particolarmente vantaggiosa come agente di spostamento perché non interferisce con il legame dell'analita T3 o T4 o del tracciante (cioè, derivati ​​T3 o T4 come enzimi, inibitori enzimatici, fluorescenti o etichette radioattive) all'anticorpo. Questo è un vantaggio rispetto ad altri agenti di spostamento classici come l'acido 8-anilino-1-naftalensolfonico (ANS) o il salicilato. Inoltre, la furosemide mantiene la sua solubilità nel sistema di reagenti di analisi che migliora le sue caratteristiche di manipolazione.

Furosemide viene aggiunta direttamente al campione con il reagente utilizzato per identificare l'ormone tiroideo libero. Può essere impiegato in qualsiasi sistema di reagenti tiroidei come quelli progettati per analisi di fluorescenza, assorbimento, chemiluminescenza o radioimmunologia. Pertanto, la furosemide è un additivo conveniente per un sistema di reagenti di analisi della tiroide come agente di spostamento o "popper". Più preferibilmente, la furosemide può essere impiegata per eliminare completamente qualsiasi altro agente di spostamento o fasi di spostamento dell'ormone precedentemente impiegati in un sistema e metodo di reagente di analisi della tiroide altrimenti convenzionale. La quantità di furosemide impiegata dipende dalla quantità richiesta per spostare l'ormone dalle proteine ​​leganti nelle condizioni del particolare dosaggio. Questo può essere facilmente determinato da coloro che sono esperti nell'uso di test dell'ormone tiroideo in funzione del campione disponibile da testare.

La furosemide (acido 4-cloro-N- (2-furilmetil) -5-sulfamoilantranilico) può essere rappresentata dalla formula di struttura come segue: EMI5.1

Analoghi o derivati ​​della furosemide che possono produrre risultati simili come agente di spostamento per un sistema reagente tiroideo e sono pertanto contemplati per rientrare nell'ambito della presente invenzione.

Il metodo della presente invenzione utilizza furosemide come agente di spostamento per gli ormoni tiroidei in uno qualsiasi di una varietà di sistemi reagenti tiroidei. La furosemide viene aggiunta al campione in una quantità sufficiente a spostare sostanzialmente tutto, preferibilmente tutto, l'ormone tiroideo legato disponibile (T3 e T4). Il campione può essere trattato con furosemide prima di aggiungere il sistema reagente scelto per quantificare l'ormone tiroideo rilasciato oppure può essere aggiunto contemporaneamente al sistema reagente.

L'agente di spostamento della furosemide può essere impiegato in uno qualsiasi di una varietà di sistemi di reagenti tiroidei per quantificare l'ormone tiroideo spostato mediante tecniche di analisi competitive o non competitive. Anche il sistema di reagenti integrato con furosemide può essere impiegato con uno qualsiasi di una varietà di metodi di rilevamento come fluorescenza, assorbimento, polarizzazione di fluorescenza, chemiluminescenza o radioattività. Etichette tipiche utilizzate nei test dell'ormone tiroideo e compatibili con la furosemide possono includere etichette enzimatiche fluorescenti, etichette chemilumenescenti, etichette colorimetriche, materiali etichettati luminenscenti, etichette radioattive ed etichette metalliche o non metalliche.

I seguenti esempi illustrano l'uso della furosemide come agente di spostamento nella misurazione degli ormoni tiroidei. ESEMPIO I

Questo esempio utilizza la furosemide come agente di spostamento nella misurazione degli ormoni tiroidei e illustra la creazione di una curva standard, per consentire una correlazione accurata di concentrazioni di T4 sconosciute con una curva standard.

I reagenti impiegati in questo saggio immunologico inibitore enzimatico erano acetilcolinesterasi, furosemide e un antisiero legante T4 o un anticorpo T4 ottenuto da una pecora immunizzata con tiroxina coniugata a tireoglobulina bovina. L'anticorpo T4 è stato utilizzato in una diluizione finale di 1: 60.000. Le fasi della procedura di dosaggio immunologico degli inibitori enzimatici sono state eseguite come descritto di seguito.

Un primo reagente acquoso consisteva in 16,6 microlitri per litro (uL / L) di antisiero antitiroxina di pecora, 34 unità per litro (U / L) di acetilcolinesterasi e 0,7 millimoli per litro (mM / L) di furosemide in un tampone Hepes con stabilizzatore proteico (0,6 moli per litro di solfato di litio).

Un secondo reagente acquoso era costituito da 8 nanomoli per litro (nM / L) di coniugato inibitore della tiroxina, 2 mM / L di 5,5 min -dithiobis- (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) e 3,85 mM / L di S- ioduro di acetil-B- (metiltio) colina in un tampone citrato.

La prima soluzione reagente è stata aggiunta a 3,6 microlitri di plasma in una quantità di 168 microlitri e miscelata. Questa miscela è stata lasciata incubare per circa cinque minuti. Successivamente, sono stati aggiunti 85 microlitri della seconda soluzione reagente e le letture dell'assorbanza sono state prese a lunghezze d'onda di 415 e 500 nanometri a intervalli di tempo definiti.

In questo test dell'ormone tiroideo, la tiroxina campione compete con un inibitore enzimatico (coniugato T4), che è strutturalmente simile alla tiroxina, per i siti di legame su un anticorpo specifico. La quantità di coniugato libero viene determinata misurando la velocità con cui si perde l'attività enzimatica. Il coniugato T4 e la tiroxina campione si legano in proporzione alle rispettive concentrazioni nella soluzione. La furosemide è usata per rilasciare la tiroxina dalle proteine ​​leganti il ​​siero e prevenire il successivo legame.

Questo test ha utilizzato 5 calibratori con quantità nominali di tiroxina alle seguenti concentrazioni 0, 3, 6, 12 e 24 microgrammi per decilitro (ug / dL). La costante di tempo per la scomparsa dell'attività enzimatica è adatta a una curva logistica a 4 parametri per generare una curva di calibrazione. L'intervallo di concentrazione dei calibratori di tiroxina (0-24 ug / dL) è adeguato per determinare con precisione la concentrazione di tiroxina nella maggior parte dei campioni di pazienti incontrati. Quando si incontrano campioni contenenti tiroxina in concentrazioni maggiori del calibratore più alto (24 ug / dL), possono essere determinati con precisione diluendo il campione con il calibratore e rianalizzando. Il valore della tiroxina del campione viene calcolato moltiplicando il risultato del campione diluito per il fattore di diluizione. ESEMPIO II

Questo esempio utilizza la furosemide come agente di spostamento nella misurazione degli ormoni tiroidei in un dosaggio immunoenzimatico. I reagenti impiegati sono stati i seguenti:

Antisiero legante T3 legato a particelle di polistirene ottenuto da una capra immunizzata con un coniugato covalente di T3 e tireoglobulina bovina. Le particelle rivestite di anticorpo vengono diluite in modo tale da ottenere la corretta risposta alla dose nel saggio. La furosemide è presente in questo reagente ad una concentrazione dello 0,0125% (peso / volume).

Un coniugato di fosfatasi alcalina T3 è stato preparato e diluito in tampone contenente stabilizzanti proteici.

Na-L-T3 di grado reagente è stato aggiunto gravimetricamente al siero umano privo di T3 a una concentrazione finale di 0, 0,5, 1, 2, 4 e 8 nanogrammi per millilitro (ng / ml). Questi materiali servivano da calibratori.

Il substrato era costituito da una soluzione acquosa tamponata di 4-metilumbelliferoil fosfato. Il diluente del saggio era costituito da 50 millimolari di Tris, NaCl 0,3 molare, pH 7,5.

Per questo test sono stati eseguiti i seguenti passaggi.

Cinquanta microlitri (ul) di calibratore o campione sono stati aggiunti a un pozzetto di reazione in polistirene. A questo sono stati aggiunti 50 ul di reagente particellare seguito da 150 ul di diluente per il dosaggio. Questa miscela è stata miscelata e incubata per circa dieci minuti a 34,5 ° C. La furosemide nel reagente particellare ha effettivamente spostato la T3 dalla proteina legante.

Un volume di 175 ul della miscela è stato trasferito su una matrice di fibra di vetro e lavato con due aliquote da 75 ul di diluente per analisi. Le particelle a cui era legato T3 rilasciato erano irreversibilmente legate alla matrice.

Il reagente coniugato fosfato alcalino T3 è stato aggiunto alla matrice e dopo un'incubazione di quattro minuti il ​​coniugato non reagito è stato lavato dalla matrice con due aliquote da 75 ul di diluente del dosaggio.

Il substrato è stato quindi aggiunto alla matrice e la velocità di formazione del prodotto, metil umbelliferone, è stata determinata mediante emissione fluorescente.

La Figura 1 mostra una tipica curva standard tracciata come velocità in conteggi al secondo al secondo (CTS / s / s) rispetto alla quantità di T3 legata misurata in nanogrammi per millilitro (ng / ml). L'intercetta del cinquanta percento è di 2,0 ng / ml e la sensibilità del test è misurata dalla sua capacità di distinguere un campione da zero con una confidenza del 95% in 0,13 ng / ml. Il grafico indica gli ottimi risultati ottenuti con il sistema reattivo tiroideo contenente furosemide.